原位分子杂交仪，Northern杂交的检测

(一)原理

Northern杂交是利用DNA可以与RNA进行分子杂交来检测特异性RNA的技术原位分子杂交仪，首先将RNA混合物按它们的大小和分子量通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，分离出来的RNA转至尼龙膜或硝酸纤维素膜上，再与放射性标记的探针杂交，通过杂交结果可以对表达量进行定性或定量。

Northern杂交是用来测量真核生物RNA的量和大小估计其丰度的实验方法，可以从大量的RNA样本同时获得这些信息。其基本步骤包括：①完整mRNA的分离；②根据RNA的大小通过琼脂糖凝胶电泳对RNA进行分离；③将RNA转移到固相支持物上，在转移的过程中，要保持RNA在凝胶中的相对分布；④将RNA固定到支持物上；⑤固相RNA与探针分子杂交；⑥除去非特异结合到固相支持物上的探针分子；⑦对特异结合的探针分子的图像进行检测、捕获和分析。ELISA试剂盒

(二)材料

1．待检测的RNA及制备好的探针。

2．试剂DEPC、琼脂糖(电泳级)、MOPS电泳缓冲液(10×和l×)、37％甲醛溶液(pH>4)、甲酰胺、甲醛加样缓冲液、SSC(10×、20×、l×、0．25×)、10mg／ml溴化乙啶、Northern杂交溶液、N0rthern杂交溶液、O．1％SDSDEPC处理的双蒸水。

3．仪器及器材60℃水浴箱原位分子杂交仪、平台式摇床、硝酸纤维素膜、滤纸、杂交袋、电泳装置和放射自显影所需试剂和设备。

(三)方法

1．凝胶或甲醛凝胶的准备

(1)配制1．2％琼脂糖凝胶：将4．2g琼脂糖加入304．5ml水中(用500ml角烧瓶)，放入微波炉内溶化后，置于60℃水浴中(凝胶量应根据所需制备的凝胶板大小来决定，一般是20cm×20cm的凝胶板)。

(2)当琼脂糖凝胶凉至60℃时，加入35ml10×MOPS电泳缓冲液，并加入10．5ml37％甲醛溶液，充分混匀。

(3)准备好电泳槽，并将加样孔成形梳插入，使梳顶端与槽底约有1mm距离，倒入上述甲醛琼脂糖凝胶溶液，冷却30～45min，小心抽出梳子，加人1×MOPS电泳缓冲液，淹没凝胶表面(加样孔大小约10mm×lmm，以便能加入约60ul样品)。ELISA试剂盒